Музыкального воспитания детей 5 страница

Рисунок 25. Анализ зависимости уровня поверхностной экспрессии TGFbRII от стадии дифференцировки макрофагов. Макрофаги культивировали в присутствии IL-4 или IL-4 в комбинации с дексаметазона в концентрации 1x10^-7M. Уровень экспрессии TGFbRII измеряли на 1, 2, 3, 4 и 5 дни при помощи проточной цитометрии. Уровень экспрессии в моноцитах был взят за 100%.

Повышенная поверхностная экспрессия TGFbRII должна приводить к эффективной активации Smad-зависимого сигнального пути при стимуляции клеток TGF-b. Для исследования активации Smad-зависимого сигнального пути было проанализировано фосфорилирование Smad2 в ответ на стимуляцию клеток TGF-b. M2_IL-4 и M2_IL-4/ГК на 5-й день культуры стимулировали TGF-b1 и при помощи Вестерн блоттинга определяли количество фосфорилированного Smad2 (Рис. 26). Было обнаружено, что уже через 10 минут стимуляции количество фосфорилированного Smad2 было не менее чем в 10 раз больше в M2_IL-4/ГК по сравнению с M2_IL-4, причем это различие сохранялось на протяжении 2 часов стимуляции. Общее количество Smad2 в M2_IL-4/ГК и M2_IL-4 различалось незначительно (Рис. 26).

Рисунок 26. Анализ фосфорилирования Smad2 в M2_IL-4/ГК и M2_IL-4 при стимуляции TGF-b1. Макрофаги культивировали в течение 5 дней и стимулировали TGF-b1 как указано. Smad2 и фосфо-Smad2 (pSmad2) исследовали при помощи Вестерн блоттинга.

Хотя уровень фосфорилирования Smad2 в M2_IL-4/ГК и M2_IL-4 существенно различался, разницы в кинетике процесса обнаружено не было. В обеих популяциях макрофагов фосфорилированный Smad2 наблюдался уже через 10 минут стимуляции и его уровень оставался неизменным на протяжении 2-х часов. Однако, как было обнаружено при анализе дифференциальной экспрессии генов, TGF-b1 активировал экспрессию Smad7 – негативного регулятора Smad-зависимого сигнального пути (Ten Dijke and Hill, 2004). Поэтому далее была исследована возможная разница в функционировании негативной регуляции Smad-зависимого сигнального пути между M2_IL-4/ГК и M2_IL-4. Для этого эксперимента были выбраны временные точки 1 час, когда наблюдается значительно количество фосфорилированного Smad2, и 24 часа. Анализ количества фосфорилированного Smad2 показал, что через 24 часа стимуляции, его количество снижается до фонового уровня в M2_IL-4, в то время как в M2_IL-4/ГК Smad-зависимый сигнальный путь сохраняет достаточно высокую активность (Рис. 27).

Рисунок 27. Анализ фосфорилирования Smad2 в M2_IL-4/ГК и M2_IL-4 при стимуляции TGF-b1. Макрофаги культивировали в течение 5 дней и стимулировали TGF-b1 как указано. Smad2 и фосфорилированный Smad2 (pSmad2) исследовали при помощи Вестерн блоттинга.

Эти данные позволяют заключить, что повышенная поверхностная экспрессия TGFbRII приводит к эффективной активации Smad-зависимого сигнального пути при стимуляции макрофагов TGF-b1. Более того, сохраняющаяся в M2_IL-4/ГК в течение 24 часов активность Smad-зависимого сигнального пути указывает на то, что негативная регуляция этого процесса замедлена или даже полностью инактивирована при стимуляции макрофагов глюкокортикоидами.

Влияние дексаметазона на негативную обратную связь Smad-зависимого сигнального пути

Для выяснения механизма замедленной негативной обратной связи, наблюдаемой в M2_IL-4/ГК, была исследована экспрессия мРНК факторов, участвующих в этом процессе. M2_IL-4/ГК и M2_IL-4 были стимулированы TGF-b1 в течение 24 часов и экспрессия мРНК Smurf2, RNF111, FKBP1A, SKIL и SIRT1 была исследована при помощи количественной ПЦР. Все вышеперечисленные факторы, за исключением SIRT1 необходимы для эффективного функционирования негативной обратной связи. Механизм действия этого процесса включает интернализацию рецептора, его полиубиквитинирование и деградацию. Отсутствие разницы в экспрессии этих факторов между M2_IL-4/ГК и M2_IL-4 (Рис. 28) позволяет предположить, что при активации Smad7 количество TGFbRII на поверхности клетки должно снижаться. Действительно, в M2_IL-4/ГК количество рецептора снижалось примерно на 30% через 24 часа стимуляции TGF-b1 (Рис. 29). Несмотря на очевидное снижение поверхностной экспрессии рецептора, вопрос о причине недостаточной активности негативной обратной связи остается.

Рисунок 28. Анализ экспрессии факторов, участвующих в регуляции негативной обратной связи Smad-зависимого сигнального пути. Макрофаги культивировали в течение 5 дней в присутствии IL-4 или IL-4 в комбинации с дексаметазоном, и стимулировали TGF-b1 в течение 24 часов. Экспрессию мРНК Smurf2, RNF111, FKBP1A, SKIL и SIRT исследовали при помощи количественной ПЦР.

Ответ на это вопрос дает анализ экспрессии мРНК SIRT1, которая оказалась повышена в M2_IL-4/ГК. SIRT1 представляет собой фермент деацетилазу, который может приводить к деацетилированию Smad7 и его инактивации. Таким образом, повышенная поверхностная экспрессия TGFbRII в комбинации с пониженной активностью негативной обратной связи приводит к продолжительной активности Smad-зависимого сигнального пути в M2_IL-4/ГК.

Рисунок 29. Анализ поверхностной экспрессии TGFbRII после 24 часов стимуляции TGF-b1. М_IL-4/ГК на 5-й день культуры стимулировали TGF-b1 в течение 24 часов. Экспрессию TGFbRII исследовали при помощи проточной цитометрии.

Проведенное исследование указывает на то, что зрелые макрофаги сохраняют способность отвечать на TGF-b и эта способность может усиливаться при использовании глюкокортикоидов в терапевтических концентрациях. Так как эффект глюкокортикоидов на макрофаги не зависит от других факторов, воздействующих на клетку, то и ответ макрофагов на TGF-b может изменяться в зависимости от цитокинового окружения. Полученные данные можно использовать для создания адекватной модели для исследования свойств опухоль ассоциированных макрофагов in vitro и поиска подходов для воздействия на их фенотип и функциональную активность.

Дата добавления: 2017-02-01; Просмотров: 40; Нарушение авторских прав?; Мы поможем в написании вашей работы!