Музыкального воспитания детей 2 страница

Основной причиной отсутствия исследований влияния TGF-b на макрофаги явилась серия работ, указывающих на то, что макрофаги теряют рецептор к TGF-b в процессе дифференцировки (Ashcroft, 1999; Brandes et al, 1991; Li et al, 2006; Wong et al, 1991). Однако, наблюдавшийся ранее эффект TGF-b на уровень экспрессии мРНК IL-17BR (Gratchev et al, 2004) позволил предположить, что в определенных условиях макрофаги сохранят способность отвечать на этот цитокин. Физиологическое значение этой способности макрофагов трудно переоценить, так как зрелые макрофаги подвергаются воздействию TGF-b в таких серьезных патологических ситуациях как злокачественные опухоли и атеросклероз. В случае опухоли макрофаги находятся в среде содержащей комбинацию цитокинов, производимых опухолевыми клетками и инфильтрирующими клетками иммунной системы. В случае атеросклеротической бляшки цитокины, воздействующие на макрофаги, производятся клетками интимы и клетками иммунной системы, инфильтрирующими бляшку. Комбинация IL-4 и TGF-b часто наблюдается как в опухолях, так и при атеросклерозе. Поэтому для исследования воздействия TGF-b на зрелые макрофаги были выбраны макрофаги второго типа, дифференцировавшиеся в присутствии IL-4 (М2_IL-4) и IL-4 в комбинации с глюкокортикоидом дексаметазон (М2_IL-4/ГК).

TGF-b1 активирует экспрессию IL-17BR не только в моноцитах, но и в зрелых макроафгах второго типа

Для описания эффекта TGF-b1 на макрофаги, эксперимент был построен следующим образом: макрофаги дифференцировались в присутствии IL-4 или IL-4 в комбинации с дексаметазоном в течение 5 дней, после чего клетки стимулировали TGF-b1. Так как TGF-b1-зависимый сигналлинг достаточно быстрый процесс (Schmierer and Hill, 2005), то экспрессия мРНК IL-17BR была исследована через 3 и 24 часа после начала стимуляции (Рис. 19). Результаты количественной ПЦР показали отсутствие эффекта TGF-b1 на экспрессию мРНК IL-17BR через 3 часа стимуляции. Через 24 часа стимуляции статистически достоверное 5-и кратное увеличение экспрессии наблюдалось в случае М2_IL-4/ГК, в то время как 2-х кратное увеличение экспрессии в случае M2_IL-4 не было статистически достоверным. Полученные результаты указывают на то, что зрелые макрофаги сохраняют способность отвечать на стимуляцию TGF-b1, причем М2_IL-4/ГК обладают этой способностью в большей степени, чем M2_IL-4.

Рисунок 19. Анализ способности TGF-b1 усилить экспрессию мРНК IL17BR в зрелых макрофагах. Макрофаги дифференцировались в присутствии IL-4 или IL-4 в комбинации с дексаметазоном в течение 5 дней. Далее макрофаги стимулировали TGF-b1 как указано. Экспрессию мРНК IL17BR исследовали при помощи количественной ПЦР. Экспрессия в М2_IL-4 на 5 день взята за 1.

Так как для М2_IL-4 и М2_IL-4/ГК была обнаружена разница в ответе на TGF-b1, далее был исследован весь спектр генов, активируемых в этих клетках TGF-b1. Макрофаги, полученные, так же как и для предыдущего эксперимента, стимулировали TGF-b1 в течение 24 часов и использовали для выделения РНК, которая была исследована при помощи биочипов фирмы Affymetrix. Для получения статистически достоверных данных в эксперименте были использованы макрофаги от 5 различных доноров. Исследование дифференциальной экспрессии генов не выявило статистически достоверных различий между M2_IL-4 и M2_IL-4 стимулированными TGF-b1 (Рис. 20). Этот результат подтверждал данные, полученные при анализе эффекта TGF-b1 на экспрессию мРНК IL-17BR (Рис. 19), а так же данные других групп, где сообщалось, что зрелые макрофаги не способны эффективно отвечать на TGF-b1 (Ashcroft, 1999). Однако, в M2_IL-4/ГК стимуляция TGF-b1 приводила к 4-х кратному и более повышению экспрессии более чем 90 генов (p<0.000001) (Рис. 20). Основываясь на полученных данных, дальнейшие исследования были сконцентрированы на M2_IL-4/ГК. Для получения данных о генах, напрямую активируемых TGF-b1, при помощи биочипов были также проанализированы M2_IL-4/ГК стимулированные TGF-b1 в течение 3-х часов. Анализ дифференциальной экспрессии генов в M2_IL-4/ГК стимулированных TGF-b1 в течение 3 и 24 часов, позволил выявить 2 группы генов, отличающихся по времени активации. Группа генов «раннего ответа» содержала 44 гена, экспрессия которых была усилена в 4 и более раз уже через 3 часа после стимуляции. Группа «позднего ответа» содержала 90 генов, экспрессия которых была усилена в 4 и более раз через 24 часа после стимуляции. 23 гена попали в обе группы. Полученных данные указывают на то, что TGF-b1 активирует сложную программу регуляции транскрипции, и наблюдаемые эффекты содержат как непосредственные эффекты TGF-b1 на экспрессию генов, так и вторичные, включающие пути передачи сигнала, использующие факторы, экспрессия которых активировалась TGF-b1 (Li et al, 2006).

Таблица 1. Функциональные группы генов, экспрессия которых увеличивалась при стимуляции TGF-b1 не менее чем в 4 раза (FC≥2)

Дата добавления: 2017-02-01; Просмотров: 40; Нарушение авторских прав?; Мы поможем в написании вашей работы!