Музыкального воспитания детей 3 страница

Среди генов, экспрессия которых усиливалась под действием TGF-b1 были выделены 5 функциональных групп (Таблица 1). Первая группа содержала 12 генов, участвующих в регуляции транскрипции, причем большинство из них (9 из 12) относились к генам «раннего ответа». Среди этих генов были обнаружены описанные Smad3-зависимые гены JUNB и FOS(Li et al, 2004) (Tаблица 1). Вторая группа содержала 5 генов, участвующих в регуляции сигнального пути, активируемого TGF-b или BMP, включая гены, отвечающие за негативную обратную связь - Smad7 и Smad6 (Piek et al, 1999). Три из 5 генов этой группы относились к «раннему ответу» (Таблица 1). Следующие 3 группы генов (регуляция иммунного ответа, транспорт и процессинг липидов, клеточная адгезия) в основном включали гены из группы «позднего ответа» (24 из 25). Гены, участвующие в регуляции иммунного ответа включали различные рецепторы, растворимые факторы, сигнальные молекулы, а так же ферменты, участвующие в синтезе лейкотриенов. Среди генов, участвующих в метаболизме липидов был рецептор для окисленных LDL, OLR1 (Draude and Lorenz, 2000), а так же и некоторые аполипопротеины (Таблица 1). Подобная классификация генов, позволяет утверждать, что при стимуляции зрелых макрофагов TGF-b1 наряду с активацией генов, напрямую зависимых от Smad, происходит повышение экспрессии ряда транскрипционных факторов, которые в свою очередь приводят к активации генов «позднего ответа».

Подтверждение данных, полученных при помощи биочипов

Для подтверждения данных, полученных при помощи биочипов, экспрессия мРНК Smad7, ID3, OLR1 и IL-17BR была исследована при помощи количественной ПЦР. M2_IL-4/ГК стимулировали TGF-b1 на 5-й день культуры, после чего клетки собирали через 1, 2, 3, 6, и 24 часа. Количественная ПЦР показала, что экспрессия мРНК OLR1 повышалась непрерывно на протяжении всего исследованного периода (Рис. 21). Повышение экспрессии мРНК OLR1 становилось статистически значимым через 3 часа стимуляции. В отличие от OLR1, увеличение экспрессии мРНК Smad7 и ID3 становилось статистически значимым уже через час после начала стимуляции клеток TGF-b1 и сохранялась на этом уровне, на протяжении всего периода стимуляции (Рис. 21). В соответствии с ранее полученными данными (Рис. 19, Таблица 1), статистически достоверное увеличение экспрессии мРНК IL-17BR наблюдалось лишь через 24 часа стимуляции (Рис. 21). Важно отметить, что степень увеличения экспрессии генов, определенная при помощи количественной ПЦР, была значительно выше, чем степень увеличения экспрессии, выявленная при помощи биочипов. Так, например, экспрессия мРНК OLR1 увеличивалась в 19.7 раз по данным биочипов, но в 180 раз по данным количественной ПЦР. Эта разница в чувствительности двух методов позволила предположить, что возможно, усиление экспрессии генов в ответ на TGF-b1 в M2_IL-4 не было обнаружено по причине низкой чувствительности метода. Для проверки этого предположения экспрессия генов «раннего ответа» была исследована в M2_IL-4 при помощи количественной ПЦР.

Рисунок 21. Анализ усиления экспрессии генов в M2_IL-4/ГК в ответ на стимуляцию TGF-b1. Макрофаги дифференцировались в присутствии IL-4 в комбинации с дексаметазоном в течение 5 дней. Стимуляция TGF-b1 проводилась, как указано. Уровень экспрессии мРНК определялся при помощи количественной ПЦР, экспрессия на момент начала стимуляции принималась за 1.

Анализ экспрессии генов «раннего ответа» в M2_IL-4 стимулированных TGF-b1

М2_IL-4 на 5-й день культуры стимулировали TGF-b1 в течение 3 и 24 часов, после чего экспрессию мРНК OLR1, Smad7 и ID3 измеряли при помощи количественной ПЦР. Действительно, статистически значимое увеличение экспрессии мРНК было обнаружено в случае ID3 и OLR1 после 24 часов стимуляции. Однако, степень увеличения экспрессии бала существенно меньше, чем в случае M2_IL-4/ГК. Так, через 3 часа стимуляции TGF-b1, в M2_IL-4 экспрессия мРНК Smad7 была увеличена в 2 раза, в то время как в M2_IL-4/ГК она была увеличена в 20 раз. Похожая разница была обнаружена в случае мРНК ID3 (4 раза в M2_IL-4 и 30 раз в M2_IL-4/ГК) и OLR1 (1.6 раза в M2_IL-4 и 12 раз в M2_IL-4/ГК). Через 24 часа стимуляции эта разница становилась еще более выраженной в случае мРНК OLR1 (2.5 раза в M2_IL-4 и 180 раз в M2_IL-4/ГК). Вместе с данными, полученными при помощи биочипов, результаты количественной ПЦР указывают на то, что дексаметазон влияет на способность макрофагов отвечать на TGF-b. Предположительно, обработка макрофагов дексаметазоном приводит к появлению фундаментального молекулярного различия в TGF-b-зависимом сигнальном пути между M2_IL-4 и M2_IL-4/ГК.

Так как регуляция экспрессии рецепторов для TGF-b на уровне мРНК была описана в макрофагах (Ashcroft, 1999; Pioli et al, 2004) и опухолевых клетках (Peltier et al, 2003), экспрессия мРНК TGFbRI (ALK5) и TGFbRII в разных популяциях макрофагов была исследована при помощи количественной ПЦР. Макрофаги культивировали в течение 5 дней в среде без стимуляторов, в присутствии дексаметазона, IL-4 и их комбинации. Полученные данные показали, что дексаметазон приводит к двухкратному повышению экспрессия мРНК рецепторов, которое не является статистически значимым. Исследование общего количества белка TGFbRII так же не выявило существенных различий между макрофагами, стимулированными и не стимулированными дексаметазоном.

Так как активность рецептора может регулироваться на уровне поверхностной локализации, экспрессия TGFbRII и endoglin (вспомогательный рецептор для TGFb) на поверхности макрофагов была исследована при помощи проточной цитометрии. Эксперимент показал, что TGFbRII экспрессируется на высоком уровне на поверхности макрофагов, стимулированных дексаметазоном (M2_ГК) или его комбинацией с IL-4 (M2_IL-4/ГК). При этом поверхностная экспрессия TGFbRII была значительно ниже в случае нестимулированных макрофагов, и полностью отсутствовала в случае M2_IL-4 (Рис. 22). Количественный анализ полученных данных показал, что дексаметазон приводит к 13 кратному увеличению поверхностной экспрессии TGFbRII в M2_ГК по сравнению с контрольными макрофагами и более чем 20 кратной разнице между M2_IL-4/ГК и M2_IL-4 (Рис. 22). В то же время endoglin экспрессировался в равной степени на поверхности всех исследованных популяций макрофагов, указывая на то, что наблюдаемый эффект не является общим для всех рецепторов к TGFb, а специфичен для TGFbRII.

Дата добавления: 2017-02-01; Просмотров: 49; Нарушение авторских прав?; Мы поможем в написании вашей работы!