Музыкального воспитания детей 4 страница

Рисунок 22. Анализ поверхностной локализации рецепторов TGFbRII и endoglin. Макрофаги культивировали в течение 5 дней в присутствии дексаметазона и IL-4 как указано. Поверхностную экспрессию рецепторов исследовали при помощи проточной цитометрии.

Для исследования влияния дексаметазона на экспрессию TGFbRII в присутствии цитокинов, отличных от IL-4, макрофаги культивировали в среде с добавлением IL-13, M-CSF и GM-CSF в комбинации с дексаметазоном или без него. Исследование поверхностной экспрессии TGFbRII через 5 дней культуры показало, что, так же как и IL-4, IL-13 приводил к снижению уровня экспрессии TGFbRII до фонового уровня. Стимуляция макрофагов M-CSF приводила к сохранению хорошо определяемой экспрессии TGFbRII на поверхности клеток, в то время как стимуляция GM-CSF приводила к сохранению лишь незначительной экспрессии TGFbRII. Добавление дексаметазона в культуральную среду приводило к существенному повышению количества TGFbRII на поверхности клеток независимо от стимуляции.

Для исследования способности этих макрофагов отвечать на TGF-b1, была проанализирована экспрессия мРНК генов OLR1, IL17BR, ID3 и Smad7. Макрофаги культивировали 5 дней в среде, содержащей IL-13, M-CSF или GM-CSF с добавлением и без добавления дексаметазона и стимулировали TGF-b1 в течение 24 часов (Рис. 23). Количественная ПЦР показала, что экспрессия мРНК IL17BR и Smad7 не может быть активирована TGF-b1 в контрольных макрофагах и макрофагах, стимулированных каждым цитокином в отдельности без добавления дексаметазона. В то же время, экспрессия мРНК ID3 и OLR1 повышалась в ответ на стимуляцию TGF-b1 в контрольных макрофагах и макрофагах, стимулированных M-CSF (Рис. 23). Эти данные хорошо согласуются с обнаруженной остаточной экспрессией TGFbRII в контрольных макрофагах и макрофагах, стимулированных M-CSF.

Стимуляция макрофагов дексаметазоном, независимо от того в какой комбинации он использовался, приводила к существенному увеличению экспрессии мРНК OLR1, ID3 и Smad7 в ответ на TGF-b1. Для IL17BR, существенное увеличение экспрессии наблюдалось только в случае стимуляции макрофагов комбинацией IL-13 и дексаметазона, так как необходимым условием для включения экспрессии гена IL17BR является наличие в среде IL-4 или IL-13 (Gratchev et al, 2004).

Рисунок 23. Исследование способности макрофагов отвечать на стимуляцию TGF-b1. Макрофаги культивировали в среде с добавлением цитокинов и дексаметазона, как указано, в течение 5 дней и стимулировали TGF-b1 в течение 24 часов. Экспрессию мРНК OLR1, IL17BR, ID3 и Smad7 исследовали при помощи количественной ПЦР.

Для исследования зависимости уровня поверхностной экспрессии TGFbRII от концентрации дексаметазона, использованного для стимуляции, макрофаги культивировали в течение 5 дней в присутствии IL-4 и различных концентраций дексаметазона в диапазоне от 1x10^-7 до 1x10^-9M. Уровень поверхностной экспрессии определялся при помощи проточной цитометрии. Эксперимент показал четкую зависимость уровня экспрессии TGFbRII от концентрации дексаметазона. Различие между клетками, стимуляция которых включала дексаметазон, и контрольными клетками, стимулированными только IL-4, становилось статистически достоверным при концентрации дексаметазона 1x10^-8 M. Эта концентрация попадает в диапазон, соответствующий диапазону физиологических концентраций кортизола в крови здорового взрослого человека (от 4x10^-9 до 2x10^-8M) (Рис. 24). Стоит отметить, что концентрация 1x10^-8 M приводит к уровню поверхностной экспрессии TGFbRII, который лишь в 3 раза ниже, чем уровень экспрессии, наблюдаемый на поверхности макрофагов, обработанных фармакологической концентрацией дексаметазона - 1x10^-7M (Рис. 24), которая обнаруживается в крови пациентов при системной терапии с использованием глюкокортикоидов, например при лечении ревматоидного артрита (Wenting-Van Wijk et al, 1999).

Рисунок 24. Анализ зависимости уровня поверхностной экспрессии TGFbRII от концентрации дексаметазона. Макрофаги культивировали в течение 5 дней в присутствии IL-4 и различных концентраций дексаметазона. Уровень экспрессии TGFbRII измеряли при помощи проточной цитометрии. Уровень экспрессии в макрофагах стимулированных IL-4 и дексаметазоном в концентрации 1x10^-7M был взят за 100%.

Для понимания, является ли изменение уровня поверхностной экспрессии TGFbRII прямым эффектом дексаметазона, или же это результат сложных процессов, происходящих при дифференцировке макрофагов, была исследована кинетика увеличения поверхностной экспрессии TGFbRII. Макрофаги культивировали в присутствии IL-4 или комбинации IL-4 и дексаметазона в концентрации 1x10^-7M. Поверхностная экспрессия TGFbRII исследовалась на 1, 2, 3, 4 и 5 дни культуры при помощи проточной цитометрии. Эксперимент показал, что в M2_IL-4 экспрессия TGFbRII падала до уровня фона в течение первых 3-х дней культуры (Рис. 25). Эти данные хорошо согласуются с опубликованными данными о потере поверхностной экспрессии TGFbRII макрофагами (Ashcroft, 1999). При этом в M2_IL-4/ГК поверхностная экспрессия TGFbRII незначительно снижалась после 1 дня культуры, и затем непрерывно повышалась, достигая плато на 4-й день культуры (Рис. 25). Разница в поверхностной экспрессии TGFbRII между M2_IL-4 и M2_IL-4/ГК становилась статистически достоверной уже на 1-й день культуры (Рис. 25). Полученные данные указывают на то, что для поддержания поверхностной экспрессии TGFbRII, глюкокортикоид должен присутствовать в культуральной среде на протяжении всего периода дифференцировки макрофагов. Таким образом, можно утверждать, что физиологические концентрации глюкокортикоидов достаточны для поддержания способности макрофагов отвечать на TGF-b. При этом особое внимание следует уделять повышению поверхностной экспрессии TGFbRII наблюдаемому при повышении концентрации глюкокортикоидов. Этот эффект небходимо учитывать при использовании глюкокортикоидов в терапевтических целях.

Дата добавления: 2017-02-01; Просмотров: 39; Нарушение авторских прав?; Мы поможем в написании вашей работы!