Зберігання ембріонів

Кріоконсервування ембріонів. Перші досліди із заморожування ембріонів провели у 1978 р. С.М. Уілраден, К. Полдж і Л.Е. Роусон. Згодом С.П. Лейбо (1984) удосконалив застосовану ними методику, проте для перенесення цих розробок на сільськогосподарські тварини потрібно було ще 20 років досліджень.

Нині ембріони заморожують методом програмного одноступінчастого заморожування, або ж одномоментним методом (вітрифікація).

Низькотемпературна консервація ембріонів сільськогосподарських тварин для наступної їх трансплантації має велике практичне значення. Воно дає можливість тривалий час зберігати цінний генетичний матеріал, відпадає необхідність в утриманні великих стад реципієнтів, значно спрощує експорт і імпорт ембріонів. Стає можливим зберігання генофонду рідкісних і зникаючих порід тварин.

Передумовою кріобіологічної технології ембріонів є принцип зберігання ізольованих клітин у суспензіях, наприклад, сперміїв, еритроцитів, лімфоцитів і різних ліній культивованих клітин. Проте різним типам і колоніям клітин властивий свій режим охолоджування та відтаювання, і вони можуть бути змінені відповідно до специфіки клітини.

Найважливіший фактор у процесі заморожування ембріонів − швидкість охолоджування, яка для багатьох клітин становить 1°С за одну хвилину. Однак, оптимальна швидкість охолоджування, що забезпечує максимальний рівень виживання для різних типів клітин, значно варіює для ембріонів різних видів тварин.

Великий вплив на життєздатність клітин виявляє і швидкість відтаювання, що залежить від швидкості охолоджування. При швидкому охолоджуванні рівень виживання вищий за умовою швидкого відтаювання, повільне охолоджування потребує повільного відтаювання.

Оптимальною стадією для заморожування ембріонів великої рогатої худоби є рання бластоциста, ембріонів овець і кіз − пізня морула чи рання бластоциста, ембріонів свиней − бластоциста. Краще переносять заморожування свіжі ембріони.

Але за заморожування ембріонів нижче 0°С в них можуть виникати такі пошкодження:

− створюються кришталики криги;

− зникає вода;

− збільшується концентрація розчинених речовин у клітині (тобто осмотичний шок).

За дуже повільного заморожування криштали криги не утворюються, але спостерігається зневоджування клітини, швидке заморожування викликає утворення кришталів. Для вирішення цієї проблеми використовують кріопротектори, що поділяються на дві групи:

−внутрішні − це ті, що вводять усередину клітини для запобігання створенню криги. Як кріопротектор використовують диметилсульфоксид (ДМСО), гліцерин, етиленгліколь, етанол та ін.;

− зовнішні кріопротектори нездатні потрапляти всередину ембріона, але вони запобігають осмотичному руйнуванню клітини, коли під час відтаювання вода дуже швидко потрапляє всередину клітини, а внутрішній кріопротектор виходить назовні повільно, що викликає набухання і пошкодження ембріона. Як зовнішні кріопротектори використовують полівінілпіррралідон (ПВП), а в основному розчин сахарози.

Слід підкреслити, що процес заморожування ембріонів є набагато складнішим від заморожування сперми, оскільки ембріони є багатоклітинними утвореннями. Тому дуже важлива роль відводиться підготовці ембріонів до заморожування, їх захисту від температурних та осмотичних пошкоджень.

У процесі заморожування ембріонів спочатку знижується температура в навколоклітинному середовищі, тут поступово збільшується кількість криги, в той час як в решті розчину зростає концентрація солей. Таким чином виникає різниця осмотичного тиску між позаклітинною та внутрішньоклітинною фазами, яка може бути зрівноважена шляхом віддачі клітинами води у позаклітинне середовище.

Для уникнення кристалізації внутрішньоклітинної води до складу середовища додають кріопротектори діметилсульфоксид (ДМСО) чи гліцерин, а щоб не допустити осмотичних зрушень − штучно стимулюють кристалізацію на певній стадії. Проте саме введення до складу середовища з ембріонами кріопротектора, як і його видалення, може викликати осмотичні зрушення. Тому це насичення (еквілібрацію) роблять поступово, поміщаючи ембріони на годинникових скельцях у чашках Петрі спочатку на 5... 10 хв. у 0,25 М розчин ДМСО, тоді − в 0,5 М, 1,0 М і, нарешті, в 1,5 М розчин. У останньому розчині ембріони витримують 15... 20 хв. Якщо кріопротектором є гліцерин, то спочатку ембріони поміщають на 10 хв. у 3,3-процентний його розчин, тоді на 14 хв. у 6,6%- процентний і, нарешті, на 30 хв. у 10-процентний розчин. Після розморожування ембріонів їх також відмивають від кріопротектора, переносячи поступово з розчинів з більшою концентрацією кріопротектора у менш концентровані розчини.

За наявністю ембріонів відмінної якості можна використовувати спрощений спосіб насичення кріопротектором, за якого ембріони відразу переносять у 1,0 М або 1,4 М розчин гліцерину і витримують до 30 хвилин.

Закінчивши насичення ембріонів кріопротектором, їх розфасовують по 1...4 шт. упробірки, ампули чи пайєти для заморожування, яке проводять одно- чи двоетапним методом, повільно чи швидко. У пайєти ембріони поміщають у такій послідовності: середовище-повітря-середовище з ембріоном-повітря-середовище. Кожен стовпчик повинен займати в пайєті до1...2 см довжини. Один край пайєти закривають зволоженим корком (рис. 57).

Рис. 57. Схема послідовності операцій заморожування ембріонів

Для зниження перепаду температур і уникнення осмотичних змін за температури 4...5°С до початку кригоутворення стимулюють кристалізацію, додаючи до розчину шматочок криги, кристалик йодистого срібла чи просто переохолоджений предмет (проколюють фольгу пінцетом з намерзлою на кінці краплею середовища і швидко торкаються ним поверхні рідини).

Повільне заморожування і повільне розморожування ембріонів можна проводити за декількома методиками, що передбачають такі дії:

1. охолодження ембріонів від +20°С до -7°С зі швидкістю 1°С/хв.;

2. викликання кристалізації (торкаються пінцетом, переохолодженим у рідкому азоті, до поверхні контейнера, пробірки чи ампули з ембріонами;

3. подальше охолодження зі швидкістю 0,3°С/хв. до мінус 36°С;

4. подальше охолодження зі швидкістю 0,1°С/хв. до мінус 60°С;

5. перенесення у скраплений азот для швидкого охолодження. Розморожують ембріони у спиртовій бані – склянійциліндричній колбі за температури -50°С, куди поміщають пробірки чи ампули з ембріонами і розморожують за кімнатної температури зі швидкість 4°С/хв. до 10°С, після чого переносять на 5 хв. у водяну баню за температури 20°С. Нарешті, переносять ембріони у середовище для видалення кріопротектора.

Швидке заморожування та розморожування ембріонів (уперше застосував А. Массіп у 1987 р.). Охолоджують ембріони у мініпайєтах за температури від 20°С до мінус 7°С зі швидкістю 1°С/хв., викликають кристалізацію, тоді охолоджують зі швидкістю 0,3°С/хв. лише до температури -30°С, після чого переносять у скраплений азот. Розморожують ембріони у водяній бані за температури 37°С протягом 30 сек. зі швидкістю 3,0°С/хв.

НДІ тваринництва Лісостепу і Полісся запропонував технологію заморожування ембріонів за якої свіжовимиті ембріони переносять на 10 хв. у 0,5 М розчин ДМСО на середовищі ФБС, тоді на 20 хв. у таке ж середовище з 1,3 М ДМСС, після чого по 3...4 зародки переносять в уленгутівську пробірку з 0,5 мл ЇМ ДМСО на ФБС, герметизують пробірку і поміщають у програмний апарат для охолодження і заморожування.

Заморожування ведуть за такою програмою: від 22...25°С до -6°С зі швидкістю 1°С/хв. штучно збуджують кристалізацію середовища і заморожують від -6°С до -40°С зі швидкістю 0,3°С/хв., від -40°С до -60°С зі швидкістю 0,1°С/хв., після чого переносять пробірки з охолодженими до температури -60°С ембріонами у скраплений азот.

Останнім часом запропоновані технології заморожування ембріонів у соломинках, які містять одночасно два середовища − для заморожування (рідина Дюльбекко з 10-процентним гліцерином і поміщеним у ній ембріоном) і середовище для розморожування (рідина Дюльбекко з 20% фетальної сироватки і 0,5 М розчином сахарози). Після розморожування соломинку струшують (для змішування середовищ), витримують 10...20 хв. за кімнатною температурою і пересаджують ембріон реципієнту.

Чутливість ембріонів до охолодження залежить від виду тварини. Ембріони свиней особливо чутливі до охолодження. Поки що не вдалося зберегти життєздатність ембріонів свиней на ранніх стадіях розвитку після охолодження їх нижче 10... 15°С (С. Полдж, 1982). Ембріони великої рогатої худоби на ранніх стадіях розвитку також − дуже чутливі за охолодження до 0°С. Однак, на більш пізніх стадіях розвитку, таких як морула або бластоциста, вони добре витримують охолодження. Ембріони овець переносять охолодження до 0°С на будь-яких стадіях розвитку, від одно-, двоклітинної стадії до бластоцисти.

Успішне заморожування і відтаювання ембріонів овець уперше було проведено С. Вілладсеном й ін. (1974). Ембріони повільно охолоджували (від 0,3 до 2,0°С/хв.) і повільно розморожували (від 4 до 25°С/хв.). Як кріопротектор застосовували ДМСО. Пізніше встановлено, що за використання 1,5 М ДМСО у фосфатному буфері заморожування зі швидкістю 1°С/хв. до -120°С супроводжувалося виживанням ембріонів тільки в тому разі, якщо застосовувалося швидке відтаювання (360°С/хв.). Однак, при заморожуванні зі швидкістю 0,3°С/хв. було збережено виживаність ембріонів як за швидкого, так і при повільного відтаювання (10 або 4°С/хв.). За подальшого зменшення швидкості заморожування до 0,1°С/хв. в інтервалі температур між -30 і -60°С повільне відтаювання було обов'язковим.

Перше лоша було отримано після пересадження 11 заморожено-розморожених ембріонів, використаних на 6-й день після овуляції. Повідомлялося про одержання двох лошат після хірургічного пересадження чотирьох шестиденних заморожених ембріонів трьом реципієнтам.

Таким чином, установлено, що ембріони великої рогатої худоби в перші дні розвитку особливо чуттєві до охолодження, але коли вони досягають стадії бластоцисти, то стійкі до охолодження в більш широкому діапазоні стадій розвитку. У свиней на жодній стадії розвитку ембріони не виживають після охолодження їх до температури нижче 10...15°С. Досягнуто успішне заморожування до 196°С і відтаювання ембріонів великої рогатої худоби, овець і коней на стадіях морули і бластоцисти з одержанням живого потомства у всіх трьох видів тварин. На практиці цей прийом використовують лише за розведення великої рогатої худоби.

Вітрифікація. Значнимспрощеннямпроцедурикріоконсервування ембріонів ссавців є метод вітрифікації, що легкий у застосуванні, швидко використовується, не потребує контролю зміни температур. Головною властивістю вітрифікаційної суміші є висока концентрація проникаючих (внутрішніх) криопротекторів, що за низької температури стають желеподібними і в результаті застигають у склоподібній формі.

При цьому не утворюються кристали криги, які є однією із головних проблем руйнування клітин у процесі кріоконсервації. Хоча одержані поза організмом ембріони великої рогатої худоби мають підвищену чутливість до заморожування-відтаювання, вітрифікація може забезпечити кращу виживаність, ніж програмне заморожування. Недоліком цього методу є токсичність кріопротекторів, що входять до вітрифікаційного розчину, внаслідок їх високих концентрацій під час еквілібрації, яка необхідна для проникнення кріопротектора в клітини і запобігання формування внутрішньоклітинної криги. Порівнюючи токсичність різних внутрішніх кріопротекторів за дії на морули мишей, доведено, що етиленгліколь є найменш токсичним (98% виживаності іп vitroо), більша токсичність спостерігалася для гліцерину − 88%, для ДМСО − 68%, для пропіленгліколю − 16%.

Для проникаючих агентів важливою характеристикою є їх здатність до швидкого проникнення агента, що може забезпечити менш тривалу еквілібрацію, дифузія води із клітини пройде швидко і, таким чином, зменшиться ризик осмотичних пошкоджень і токсичного впливу на клітини. Серед розглянутих кріопротекторів кращим за проникністю є етиленгліколь.

До вітрифікаційних розчинів додають і непроникаючі (зовнішні) агенти, які мають значний осмотичний ефекти. Серед них найчастіше використовується сахароза.

Дата добавления: 2017-02-01; Просмотров: 130; Нарушение авторских прав?; Мы поможем в написании вашей работы!